Genetische methodieken en data uitwisseling

Ten behoeve van dit rapport werd op basis van een enquête en een workshop een verkenning uitgevoerd onder een internationale groep van onderzoekers betrokken bij genetische monitoring van wolvenpopulaties in diverse delen van Europa. Op deze wijze werd een beeld verkregen in hoeverre een verbetering van de huidige methoden voor soortbepaling, individuele herkenning en detectie van hybriden wenselijk en (binnen afzienbare tijd) mogelijk is. Hieruit kwam naar voren dat de methoden die de afgelopen decennia de standaard zijn geweest en die ook in Nederland, België en Duitsland worden toegepast, betrouwbare resultaten bieden. Dit betreft een soortbepaling op basis van het uitlezen van de code van een stukje van het mitochondriaal genoom (mtDNA) en analyse van een set (ook wel: panel) microsatelliet-merkers voor individubepaling. 

Met name indien de monsteraantallen voor periodieke monitoring toenemen, valt echter nog winst te behalen in met name de doorlooptijd en kostenefficiëntie. Een overstap naar analyse via zogenaamde High-throughput sequencing (HTS) lijkt hiervoor het kansrijkst, en biedt de kans om in één analyserun een groter aantal monsters te verwerken en daarbij per monster direct een combinatie van verschillende typen DNA-merkers te analyseren waarmee meerdere onderzoeksvragen tegelijk worden beantwoord: sequentie-merkers voor soortbepaling, microsateliet-merkers en/of SNP- (single nucleotide polymorphism) merkers voor individuele herkenning en een gerichte set van SNP-merkers voor detectie van hybriden. Deze methodiek wordt steeds goedkoper en een overstap is wellicht binnen enkele jaren zinvol. Dit hangt echter wel af van het vermogen van deze methode om het slagingspercentage voor non-invasieve monsters (zoals keutels en slijmresten, kortom de overgrote meerderheid van de in Nederland verzamelde monsters) ten minste gelijk te houden en idealiter te verbeteren. Mocht dit in de praktijk tegenvallen, dan is voor individuele herkenning een alternatief denkbaar via de analyse van een gericht panel van SNP-merkers op het zogenaamde Fluidigm-platform, waarmee in onder andere Duitsland (SGN) en Finland (Universiteit van Oulu) goede ervaringen zijn opgedaan.

Recent (Harmoinen et al., 2021) is een vergelijkbaar gericht SNP-panel ontwikkeld voor een gedetailleerde detectie van wolf-hond-hybriden, waarbij onderscheid kan worden gemaakt tussen een eerste generatie hybride (F1) en diverse niveaus van terugkruising met hond of wolf. Implementatie van dit panel zou op korte termijn ook in Nederland al waardevol zijn. Nu al worden incidenteel monsters naar SGN gestuurd voor nadere verificatie middels dit SNP-panel.

Een nadeel van de HTS-methode is dat de (kosten)efficiëntie alleen wordt waargemaakt indien een groot aantal monster tegelijk kan worden verwerkt. Voor spoedbepalingen van soort of individu zal het daarom vermoedelijk nuttig blijken om ook de huidige mtDNA- en microsatelliet-methoden voorlopig nog operationeel te houden. Een mogelijk waardevolle aanvulling daarop is een nieuwe detectiemethode op basis van het amylase-gen (dat betrokken is bij de afbraak van zetmeel, en vanwege hun zetmeelrijkere dieet bij gedomesticeerde honden in een hoger aantal kopieën in het genoom aanwezig is). Deze methode biedt relatief snel en goedkoop resultaat, maar is wel minder betrouwbaar en moet daarom vooral als aanvullend worden beschouwd op de meer robuuste mtDNA- en microsatelliet-bepalingen.

Huidige werkwijze en genetische methodiek

Genetische analyse op monsters van mogelijke wolven vindt in Nederland op dit moment plaats voor twee verschillende doelstellingen. Het eerste doel is om bij schade aan landbouwhuisdieren vast te kunnen stellen welk dier de schade heeft veroorzaakt. Dit kan een wolf zijn, maar ook een hond of een vos. Wolven doden hun prooi veelal door een keelbeet. Daarbij laten ze speeksel achter. Het speeksel is een belangrijke bron van DNA waarmee op het laboratorium kan worden vastgesteld of sprake was van een wolf of een ander dier. Wanneer een veehouder melding doet bij BIJ12 van gedode of gewonde landbouwhuisdieren en het vermoeden is dat het om een wolf gaat, worden binnen 24 uur door een taxateur enkele DNA-monsters afgenomen van speekselresten in en rond bijtwonden (via swabs) en opgestuurd naar Wageningen Environmental Research (WENR) voor een genetische soortbepaling. Een dergelijke soortbepaling vindt maandelijks plaats, voor alle monsters die in de voorgaande maand zijn binnengekomen. 

Een belangrijk tweede doel van genetisch onderzoek is om te volgen hoe de wolvenpopulatie in Nederland zich ontwikkelt, conform het monitoringsplan Wolf (Klees et al., 2018). Hiervoor wordt gebruikgemaakt van bijvoorbeeld cameravallen, maar vormt DNA-sporenonderzoek de ruggengraat van de monitoring van wolven. Deze sporen kunnen bijvoorbeeld keutels of haren zijn, of swabs afgenomen bij aangetroffen wilde prooien (o.a. ree, hert, wildzwijn). Deze monsters worden door vrijwilligers verzameld, onder coördinatie van het Wolvenmeldpunt, en per kwartaal op het genetisch laboratorium verwerkt. Daarbij wordt allereerst eenzelfde soortbepaling uitgevoerd als hierboven omschreven voor schadegevallen. Op alle monsters waarin DNA van een wolf werd bevestigd, inclusief monsters verzameld bij schadegevallen, wordt vervolgens een vervolganalyse uitgevoerd, gericht op vaststellen van het geslacht en het exacte individu. Deze analyse zoomt in op stukjes van het DNA die samen een profiel vormen dat voor elke individuele wolf uniek is. Van elk geselecteerd monster wordt zo’n DNA-profiel opgesteld. Zo kan achterhaald worden of het om een nieuw individu gaat of een individu dat al eerder is waargenomen. Ook kan worden achterhaald uit welke Europese wolvenpopulatie het individu afkomstig is en in een groot aantal gevallen kan ook de roedel van herkomst worden vastgesteld. De uitkomsten van deze analyses ten behoeve van monitoring worden een keer per kwartaal gerapporteerd via de kwartaalrapportages uitgebracht door BIJ12. 

De methode die momenteel voor Nederlandse monsters door WENR wordt toegepast voor soortbepaling is gebaseerd op het vaststellen van de DNA-sequentie van een gedeelte van de sterk variabele ‘control region’ (CR) van het mitochondriale DNA (Caniglia et al., 2012). Het opstellen van een individueel genetisch profiel (ook wel: genotypering) gebeurt op basis van een vaste set van 13 microsatelliet-merkers gelegen op het nucleaire genoom, plus een sekse-merker gelegen op het 
Y-chromosoom. Voor een uitgebreide beschrijving van de gebruikte methodieken wordt verwezen naar Bijlage 3 en website van het CEwolf-consortium.

Europa-brede inventarisatie van behoeften en kansen voor toekomstige verbetering van methodieken

Ten minste 29 verschillende genetische laboratoria uit 18 verschillende landen zijn momenteel actief betrokken in genetisch onderzoek aan Europese wolvenpopulaties (waarvan 25 reeds genoemd in De Groot et al., 2016; daarnaast INBO en Universiteit van Luik voor wolven in respectievelijk Vlaanderen en Wallonië, de Universiteit van Ljubljana voor Slovenie, NINA voor Noorwegen en de Universiteit van Wenen voor Oosternrijk). De meeste van deze instituten voeren op regelmatige basis soortbepalingen en individuele genotypering uit op wolvenmonsters en denken na over manieren om hun werkwijze verder te verbeteren. Om een zo compleet mogelijk beeld te krijgen van kansen om de methodiek zoals in Nederland toegepast verder te verbeteren, was het dan ook waardevol om de ervaringen en ideeën van deze buitenlandse onderzoekers nader uit te vragen. Binnen de huidige opdracht is zo’n uitvraag in twee stappen uitgevoerd. Allereerst is in juni een digitale enquête toegestuurd aan in totaal 32 onderzoekers van laboratoria uit 17 verschillende landen (waaronder voor elk van de 10 Europese wolvenpopulaties ten minste één betrokken laboratorium). De exacte vragenlijst en een lijst van benaderde onderzoekers zijn via WENR opvraagbaar. Binnen de noodzakelijkerwijs korte responsperiode werd de enquête beantwoord door 12 onderzoekers uit in totaal 10 verschillende landen. Samen vertegenwoordigen zij onderzoek aan 6 van de 10 wolvenpopulaties (Centraal-Europa, Scandinavië, Karelië, Dinarisch/Balkan, Frans-Italiaans-Zwitserse Alpen en NW Iberia). Vervolgens werd op 11 juni 2021 een digitale workshop georganiseerd, waarvoor dezelfde groep onderzoekers werd uitgenodigd. Hierbij konden 11 deelnemers aanwezig zijn (Bijlage 2), waaronder onderzoekers betrokken bij monitoring van wolven in 7 verschillende landen, en eerste of laatste auteurs van overkoepelende onderzoekstudies aan alle Europese wolvenpopulaties (zoals Stronen et al., 2013; Pilot et al., 2010; De Groot et al., 2016) en publicaties van nieuwe genetische methodieken voor Europese wolven (zoals Kraus et al., 2015; Harmoinen et al., 2021). Tijdens deze workshop werden de belangrijkste resultaten van de enquête gepresenteerd en op relevante onderdelen nader bediscussieerd en van context voorzien. 

De enquête en workshop had betrekking op 1) behoeften en ontwikkelingen in methodieken voor soortbepaling, individuele herkenning en detectie van wolf-hond-hybriden; en 2) de behoefte aan een geschikte methode voor uitwisseling van genetische data. Hieronder worden de belangrijkste conclusies samengevat. Ten behoeve van de leesbaarheid komen hierin niet integraal de resultaten van de enquête terug; deze zijn terug te vinden in Bijlage 2.

Behoeften en randvoorwaarden bij doorontwikkeling van genetische methodieken

Hoewel de huidige methoden met succes worden toegepast, is op een aantal vlakken nog verbetering mogelijk. Deze behoeften worden hieronder opgesomd, en zijn tevens randvoorwaarden waaraan toekomstige methoden idealiter zouden moeten voldoen. In hoeverre nieuwe ontwikkelingen dit ook binnen afzienbare tijd haalbaar maken, wordt in het vervolg van dit hoofdstuk nader uitgewerkt.

1. Toepasbaarheid op non-invasieve monsters

Genetische monitoring van wolven is voor het overgrote deel (95 tot 100% van de monsters, op basis van de enquête) gebaseerd op zogenaamde non-invasieve monsters: genetische materiaal dat de wolf achterlaat via speeksel op kadavers, keutels, haren, urine, bloeddruppels etc. Dergelijke monsters bevatten vrijwel per definitie minder DNA, van een lagere kwaliteit, dan een stukje weefsel of bloedmonster van een wolf. Werken met dit type materiaal vraagt om strak gehanteerde protocollen en voldoende replicatie. Bij elke analyse zal een zeker percentage van de monsters uitvallen, omdat de DNA-kwaliteit onvoldoende was (bijvoorbeeld doordat te laat werd bemonsterd of de keutel of het kadaver lang in de harde regen of hoge temperaturen heeft gelegen). Bij methodiekontwikkeling is het streven uiteraard om het succespercentage zo hoog mogelijk te laten zijn. Hoe beter een methodiek kan omgaan met monsters van lage kwaliteit, hoe beter deze methode bruikbaar is voor monitoring. 

2. Kosten-efficiëntie versus doorlooptijd van analyses

Gezien het grote aantal monsters dat wordt verzameld en de bekostiging van analyses via gemeenschapsgeld, is het van belang de kosten waar mogelijk te drukken. Een belangrijke manier om dat te bereiken, is door methoden te gebruiken waarbij een zo groot mogelijk aantal monsters tegelijk kan worden verwerkt. Vaak liggen de kosten per analyserun ongeveer vast en hoe meer data in één keer kunnen worden verkregen, hoe goedkoper dus de kosten per monster. Het loont dus om monsters op te sparen om zo het aantal beschikbare posities per analyserun optimaal op te vullen. Daar tegenover staat de wens om zo snel mogelijk een antwoord beschikbaar te hebben. Daarvoor kan het waardevol zijn om een methodiek beschikbaar te hebben die binnen een zo kort mogelijk tijdsbestek in een antwoord kan voorzien, waarbij de analysekosten per monster van onderschikt belang zijn. 

Het blijft dus zoeken naar een balans tussen snelheid en kosten, waarbij de ideale methode afhangt van het aantal ontvangen monsters, de onderzoeksvraag en de urgentie daarvan. Flexibiliteit (schaalbaarheid) van een methode in het aantal monsters dat verwerkt kan worden, is uiteraard een voordeel. Maar in veel gevallen lijkt het nuttig om een ‘high-throughput’-methode te hebben voor periodieke analyse van een groot aantal monsters verzameld binnen een standaard monitoringsstrategie (tegen een zo laag mogelijke prijs per monster, en met idealiter resultaten voor meerdere onderzoeksvragen tegelijk) en daarnaast een methode die met spoed een heel gerichte vraag kan beantwoorden voor enkele monsters. 

3. Mogelijkheid tot uitwisseling en koppeling van data met andere landen

Uitwisseling van genetische wolvendata tussen verschillende landen is met name relevant met betrekking tot de individuele genetische profielen. Onder de bevraagde onderzoekers heerst brede consensus dat het noodzakelijk is om genetische profielen te kunnen uitwisselen en te vergelijken met instituten in directe buurlanden. De voornaamste reden is de grote afstand die wolven kunnen afleggen, waarbij zij met grote regelmaat grenzen oversteken. Voor een klein land als Nederland is dit bij uitstek relevant. Zoals ook blijkt uit het overzicht bij paragraaf 5.1, zijn de meeste in Nederland aangetoonde wolven tot nu toe afkomstig uit Duitsland en de meest individuen keerden na verloop van tijd terug naar Duitsland of liepen door naar België. Dat we deze patronen in beeld hebben weten te brengen, is volledig te danken aan de succesvolle manier waarop de methodiek voor het vaststellen van individuele genetische profielen is geharmoniseerd tussen het Duitse SGN, het Nederlandse WENR, het Vlaamse INBO en de Waalse Universiteit van Luik. Dit maakte het mogelijk om profielen verkregen in verschillende landen direct met elkaar te vergelijken en te concluderen dat het om hetzelfde dier moet gaan. Doel is hierbij dus vooral om migratiepatronen van zwervende individuen beter in kaart te brengen om zo beter te kunnen voorspellen hoe aanwezigheid van wolven zich zal ontwikkelen. Op basis van ervaringen uit andere landen lijkt het wel waarschijnlijk dat de haalbaarheid en wenselijkheid om voor elk individu diens exacte roedel van herkomst, migratieroute en plaats van vestiging te bepalen, afneemt naarmate de populatie in omvang toeneemt. In Duitsland lukt het momenteel nog om individuen en roedels grotendeels in kaart te brengen, maar het aantal monsters dat jaarlijks moet worden verwerkt om dit te bereiken, neemt met grote snelheid toe (Reinhardt et al., 2021). In Polen is monitoring vooral gericht op het in kaart brengen van het aantal territoria en roedels, in Zuid-Europese landen is monitoring vooral gericht op de populatieomvang en genetische vitaliteit. Een speciale situatie waarbij uitwisseling tussen twee buurlanden met name relevant blijft, is in het geval van een grensoverschrijdend territorium van een gevestigde wolf of roedel. Onder meer in Tsjechië is hiermee veel ervaring opgedaan en wordt om die reden nauw samengewerkt met onderzoekers in Duitsland, Polen en Oostenrijk (OWAD 2021). In Nederland is tot nu toe nog geen sprake van grensoverschrijdende gevestigde territoria, maar onder andere in het Grenspark Kalmthoutse Heide is het niet onwaarschijnlijk dat dit in de toekomst zal plaatsvinden.

Eveneens is er brede consensus dat het vaak noodzakelijk is om methoden te harmoniseren met een groter aantal landen, als zij allemaal individuen herbergen die tot dezelfde populatie behoren. Alleen op die manier is het mogelijk om de omvang en vitaliteit van de populatie als geheel te monitoren. Dit was een belangrijke reden voor de oprichting van consortium CEwolf (Bijlage 3), waarin momenteel 11 instituten samenwerken die gezamenlijk het totale leefgebied van de populatie afdekken. Vergelijkbare initiatieven bestaan reeds voor de Alpiene (Wolf Alpine Group), Scandinavische (SKANDULV) en Baltische wolvenpopulatie (BALTWOLF).

Minder overeenstemming bestaat er onder onderzoekers over de noodzaak om methoden geheel te harmoniseren tussen alle landen in Europa, om zo ook resultaten voor wolven uit verschillende populaties te kunnen vergelijken of samenvoegen. Ten behoeve van individuele herkenning van wolven worden momenteel voor verschillende wolvenpopulaties sterk verschillende sets van microsatelliet merkers gehanteerd (De Groot et al., 2016) en overstappen naar een andere merkerset of geheel andere methodiek heeft grote consequenties voor de vergelijkbaarheid ten opzichte van historische data. In de praktijk zou een flink deel van de monsters uit voorgaande jaren opnieuw moeten worden geanalyseerd. Onderzoekers geven aan dit te willen overwegen als hiermee op termijn veel efficiëntie te winnen is, maar velen zien het niet zitten om dit puur te doen met het oog op uitwisseling met andere landen. De vraag is ook in hoeverre dit noodzakelijk is. Voor academisch onderzoek waarbij patronen op Europese schaal worden onderzocht, is het efficiënter om een subset van monsters per populatie opnieuw te analyseren volgens dezelfde procedure (zoals bijvoorbeeld werd gedaan door Pilot et al., 2010). 
Vanuit het oogpunt van management en beleid beperkt de relevantie van harmonisatie zich grotendeels tot het bepalen van de populatie van herkomst. Voor dat doeleinde is een volledige overeenkomst in methodiek echter niet noodzakelijk. Een alternatief is hiervoor om tussen instituten een set van referentiemonsters uit te wisselen, afkomstig van een aantal representatieve individuen van elke populatie. Als elk instituut of consortium deze monsters met haar eigen methode analyseert, zijn deze referentiegegevens goed bruikbaar om middels clusteranalyses snel na te gaan met welke populatie een nieuw verkregen genetisch profiel de beste aansluiting heeft. 

Een uitzondering zijn gevallen waarbij een wolf met speciaal gedrag migreert naar een andere populatie. Een voorbeeld hiervan is de ‘probleemwolf’ Billy (GW1554m), die in Nederland in de regio rond Heusden voor een uitzonderlijk aantal schadegevallen zorgde. Middels uitwisseling binnen CEwolf kon deze wolf worden gevolgd terwijl deze vanuit Duitsland naar Nederland en daarna via Vlaanderen en Wallonië naar het grensgebied van Duitsland en Luxemburg trok (Figuur 4.6.2). Het vermoeden dat Billy vervolgens in Frankrijk was opgedoken, kon echter niet simpelweg worden bevestigd door het profiel dat was opgesteld door Franse onderzoekers naast de CEwolf-profielen te leggen, omdat het Franse laboratorium een andere set merkers hanteert. In het geval van Billy kon op pragmatische wijze alsnog een bevestiging worden verkregen door een Vlaams monster op te sturen naar Frankrijk, en het daar met de lokale methodiek te heranalyseren. In Frankrijk werd Billy uiteindelijk met vergunning doodgeschoten.

Al met al lijkt Europa-brede stroomlijning van methoden alleen realistisch mits het op een relatief efficiënte manier kan worden bereikt. De meeste ondervraagde onderzoekers geven aan wel bereid te zijn de set DNA-merkers die ze gebruiken (een dergelijke set wordt ook wel aangeduid als ‘panel’) uit te breiden om meer overlap met data uit andere landen te bereiken, maar de voordelen van Europa-brede harmonisatie zijn niet groot genoeg om puur om die reden een overstap naar een geheel andere methode de moeite waard te maken. 

Kansrijke toekomstige methoden voor soortbepaling

Het vaststellen van haplotypen op basis van sequentie-analyse van de ‘control region’ van het mitochondriale genoom (mtDNA) is veruit de meest toegepaste methode voor soortbepaling en wordt naar tevredenheid toegepast vanwege het hoge succespercentage op monsters van beperkte kwaliteit, omdat het een gevestigde en breed geaccepteerde methode betreft (o.a. Pilot et al., 2010) en omdat referentiedata per haplotype (de exacte DNA-code) vrij beschikbaar zijn in online databases. Het meest succesvol voor toepassing op speeksel-swabs (Caniglia et al., 2012) is de analyse van een relatief kort fragment van deze ‘control region’, waarmee haplotypen behorend tot hond, wolf en goudjakhals kunnen worden onderscheiden. Een beperking van dit fragment is dat DNA van vos niet wordt opgepikt. Hiertoe is het gebruik van een tweede (deels overlappend, maar langer) fragment nodig (Fumagalli et al., 1996). In Duitsland worden standaard voor elk monster beide fragmenten geanalyseerd; in Nederland is er vanwege kostenbesparing voor gekozen te focussen op onderscheid tussen hond, wolf en goudjakhals. Daarmee wordt de belangrijkste vraag voor toekenning van een eventuele schadevergoeding reeds beantwoord, namelijk of er bewijs is voor aanwezigheid van wolf. Indien gewenst geeft de vervolganalyse met microsatellieten alsnog uitsluitsel over aanwezigheid van vos. Een tweede beperking is dat het gebruikte mitochondriale genoom alleen via de moederlijn wordt overgeërfd. Op basis van deze methode alleen is dus niet uit te sluiten dat sprake is van een wolf-hond hybride. Bij verdachte gevallen wordt daartoe een aparte methode ingezet (zie onder). Vanwege deze beperkingen zou het nuttig kunnen zijn om in de toekomst over te gaan naar een analysemethode waarbij meerdere fragmenten tegelijk worden onderzocht (multi-locus haplotyping), door gebruik te maken van een high-throughput sequencing (HTS) platform. Dit biedt tevens kansen om merkers voor soortbepaling en voor individuele herkenning te integreren binnen een standaardset van merkers die in één run wordt geanalyseerd op een HTS-platform. Op die wijze kan voor een groot aantal monsters tegelijk zo veel mogelijk relevante informatie worden verkregen.

Hoewel zeer efficiënt voor periodieke monitoring, is een nadeel van een dergelijke methode dat deze niet geschikt is voor spoedanalyse van enkele monsters. Een nieuwe methode die in deze gevallen interessant kan zijn, richt zich op een gen voor de aanmaak van amylase, een enzym betrokken bij de afbraak van zetmeel. Bekend is dat gedomesticeerde hondenrassen in hun genoom een groter aantal kopieën van dit gen bezitten dan wolven, wat waarschijnlijk een evolutionaire aanpassing betreft aan hun relatief zetmeelrijke dieet (Axelsson et al., 2013). Dit aantal kopieën is vast te stellen via een kwantitatieve PCR-methode (Arendt et al., 2016). Binnen CEwolf wordt deze methode incidenteel toegepast door de Universiteit van Wenen en het Vlaamse INBO. Zij gebruiken daarbij een zogenaamd digital droplet PCR (ddPCR) platform, waarmee relatief goedkoop zowel een klein (tot 8) als groot (tot 96) aantal monsters tegelijk kan worden verwerkt. WENR heeft eveneens toegang tot dit ddPCR-platform en heeft reeds ervaring met het gebruik ervan voor detectie van eDNA in watermonsters. Het operationeel maken van de amalyse-detectiemethode zou echter nog een kort testtraject vereisen (test op monsters waarvan reeds bekend is welke soort of ras het betreft). Een belangrijk gegeven is wel dat hondenrassen onderling verschillen in het aantal gen-kopieën, waarbij sommige rassen een relatief laag aantal hebben en daarmee lastiger te onderscheiden zijn van wolven. Zelfs als dit slechts incidenteel voorkomt, maakt dit de methode maar beperkt inzetbaar voor een sluitend oordeel ten behoeve van bijvoorbeeld het verstrekken van een schadevergoeding. De methode moet daarmee vooral worden beschouwd als een snelle eerste indicatie en dient als aanvullend te worden gezien ten opzichte van een meer robuuste methode zoals de huidige methode op basis van mtDNA haplotypen.

Kansrijke toekomstige methoden voor individuele herkenning

Het opstellen van genetische profielen voor herkenning van individuele wolven vindt momenteel bij de meeste instituten in Europa plaats via analyse van een beperkt aantal microsatelliet merkers, waarbij de lengtevariatie per microsatelliet-fragment als een piekenpatroon wordt uitgelezen via een capillaire sequencer (ABI). Al enige jaren zijn echter alternatieve methoden in opkomst. Relevant voor toepassing in een monitoringsstrategie zijn met name: 1) de analyse van microsatelliet-merkers via high-throughput sequencing (HTS), en 2) de toepassing van een ander type merker, zogenaamde Single Nucleotide Polymorphisms (SNP’s). In beide gevallen kan een aanzienlijk groter aantal merkers tegelijk worden geanalyseerd per monster, wat de hoeveelheid arbeid per monster flink beperkt en daardoor bij grotere monsteraantallen resulteert in een kostenbesparing en wat minder gevoeligheid geeft voor de incidentele uitval van een merker. Daarnaast zijn de verkregen data van beide methoden veel makkelijker rechtstreeks te vergelijken tussen labs, zonder dat een uitgebreid validatietraject nodig is. Tot slot geldt voor beide methoden dat het exacte platform waarop de analyse wordt uitgevoerd van onderschikt belang is voor het resultaat, zodat harmonisatie tussen labs een stuk makkelijker wordt. Zolang overeenstemming wordt bereikt over het te gebruiken panel van merkers, kan ieder lab voor het genereren van data zelf kiezen welk platform de voorkeur heeft voor het uitlezen daarvan.

Analyse van microsatellieten via HTS wordt door enkele laboratoria (o.a. Universiteit van Lausanne) reeds toegepast voor onderzoek aan wolven en wordt elders reeds routinematig toegepast voor monitoring van enkele andere carnivoren. Ervaring leert echter dat het meestal niet mogelijk is om hetzelfde panel van merkers te blijven gebruiken dat eerder via capillaire sequencing werd geanalyseerd. Een overstap naar een ander panel is dus een vereiste en daarmee (voor een doorlopende dataset) ook de heranalyse van historische monsters. Hetzelfde geldt per definitie ook bij overstap op SNP-merkers. Voordeel van deze methode is dat de interpretatie van de ruwe data meer straight forward is, doordat maar vier allelvarianten mogelijk zijn per merker (de nucleotiden A, T, G en C) in plaats van een reeks van lengtevarianten. Aan de andere kant maakt deze beperkte variatie het lastiger om gemixte profielen (bijvoorbeeld door vervuiling met vos, of betrokkenheid van meerdere individuen uit een roedel) te herkennen. Voor de Scandinavische wolvenpopulatie is sinds kort een SNP-set beschikbaar die, wellicht met enige uitbreiding of aanpassing, ook bruikbaar is voor individuele genotypering in andere wolvenpopulaties. 

Een belangrijke reden dat deze methoden niet al op grote schaal worden toegepast in wolvenmonitoring was tot nu toe de beperkte toepasbaarheid op non-invasieve DNA-monsters. Voor SNP-merkers zijn in dit verband goede resultaten geboekt met het ‘microfluidic 96.96 Dynamic Array’ platform van de firma Fluidigm (hierna aangeduid als ‘Fluidigm platform’), dat echter maar in een beperkt aantal laboratoria (waaronder SGN) beschikbaar is. Door recente innovaties op het gebied van HTS-platforms lijkt sinds kort ook sequencing van non-invasieve monsters goed mogelijk (pers. comm. Dr. T. Skrbinzek). De verwachting is dan ook dat amplicon sequencing via HTS in de nabije toekomst het gebruik van Fluidigm voor SNP-analyses zal gaan vervangen. Een groot voordeel daarvan zou zijn dat analyse van een gecombineerde set van microsatelliet- en SNP-merkers dan binnen handbereik ligt en zo de voordelen van beide systemen gelijktijdig ingezet kunnen worden. De ontwikkeling en validatie van een dergelijke gecombineerde set merkers zullen echter nog wel enkele jaren in beslag nemen. 

Kansrijke toekomstige methoden voor het detecteren van wolf-hond hybriden

Onder de voor dit rapport bevraagde groep onderzoekers bestaat brede consensus dat het sterk de voorkeur verdient om onderling dezelfde methode te hanteren voor de detectie van wolf-hond hybriden. Dit heeft niet zozeer te maken met de wens tot uitwisseling van gegevens, maar met de wens om de incidentie van het optreden van hybridisatie per land op eenduidige wijze te kunnen rapporteren. Een goede optie hiervoor, die door verschillende labs ofwel al wordt toegepast of sterk wordt overwogen, is een SNP-panel dat recentelijk is ontwikkeld door Harmoinen et al. (2021), specifiek voor detectie van wolf-hond hybriden in Europa. Door SGN wordt deze set inmiddels routinematig toegepast met gebruikmaking van het Fluidigm-platform. Door WENR wordt momenteel nog primair gebruikgemaakt van de microsatelliet-profielen die reeds beschikbaar zijn voor individuele herkenning, maar worden af en toe monsters van verdachte individuen opgestuurd naar SGN voor nadere verificatie via het SNP-panel (bijvoorbeeld indien geen herkomst uit een roedel of ouderpaar bestaande uit zekere wolven kon worden vastgesteld of indien een afwijkend mtDNA haplotype werd aangetroffen). De wens bestaat om deze methode ook in Nederland in de routinematige analyse op te nemen, om zo sneller een volledig sluitend antwoord paraat te hebben. 
Een eventuele toekomstige overstap op analyse van microsatellieten en/of SNP-merkers via HTS zou wellicht de kans bieden om naast een set merkers voor soortbepaling en een set merkers voor individuele herkenning ook deze set merkers voor detectie van hybriden in een enkele analyserun uit te voeren.